Western Blot實驗技術(shù)服務(wù)

 一、概述

     蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達情況的信息。Western Blot是利用抗原抗體的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過SDS-PAGE凝膠電泳分離開，再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后再加上抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再利用發(fā)光或顯色的原理將結(jié)果顯示到膜或者底片上。

     SDS-PAGE電泳的高分辨率以及固相免疫測定的特異性和敏感性保證了終實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。WB是半定量實驗，相比較于定性實驗有數(shù)據(jù)分析，但是需要嚴(yán)格的參照標(biāo)準(zhǔn)，因此不是準(zhǔn)確的數(shù)量關(guān)系，這也是與定量試驗的不同之處。

二、技術(shù)流程;　

          蛋白提取-制膠-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學(xué)發(fā)光-結(jié)果分析;

1.根據(jù)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的位置（細(xì)胞核中，細(xì)胞漿中，細(xì)胞膜上）和目標(biāo)蛋白的性質(zhì)（變性以及非變性）選擇合適的提取蛋白的方法

2.用合適的方法例如Bradford或者BCA法測定蛋白含量

3.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小制作合適濃度的SDS凝膠

4.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小選擇合適的電泳電壓以及電泳時間

5.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小以及剪切的凝膠的大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜電流以及轉(zhuǎn)膜時間

6.根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)選擇合適的封閉方法，例如脫脂奶粉，BSA等方法封閉

7選擇合適濃度的一抗進行孵育，洗膜

8選擇合適濃度的二抗進行孵育，洗膜

9 ECL發(fā)光液進行曝光

三、客戶須知

1 檢測樣本：新鮮的組織或者細(xì)胞

2 樣本量：檢測細(xì)胞樣本的一個指標(biāo)的低細(xì)胞含量是1*106，檢測組織樣本的一個指標(biāo)的低組織樣品為30mg（建議多提供樣本，便于研磨）

3 樣本保存：

（1）新鮮的組織樣本：迅速凍存。

（2）懸浮細(xì)胞：收集完以后，冷的PBS洗3遍，吸凈殘余的液體，冷凍保存。

（3）貼壁細(xì)胞：吸凈培養(yǎng)基以后，預(yù)熱的PBS洗3遍，胰酶收集，再用冷的PBS洗3遍，吸凈殘余液體，冷凍保存；對于不適合用胰酶收集的細(xì)胞（例如胰酶處理會消化掉一部分蛋白或者對于目標(biāo)蛋白有刺激作用），預(yù)熱的PBS洗3遍以后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，吸凈殘余的液體，冷凍保存。

 4、請?zhí)崆案嬖V我們：您樣本的種屬（人、大鼠、小鼠、兔、豬等）、樣本數(shù)量、待測指標(biāo)。

5、樣本郵寄：放入冰袋或者干冰及時寄送，建議選擇順豐快遞陸運或者中通快遞陸運。

四、報告內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)

1  目的蛋白曝光照片一張

2  電子版目的蛋白和內(nèi)參的照片

3  灰度分析數(shù)據(jù)一份

4  蛋白含量數(shù)據(jù)

5  完整的實驗報告（試驗方法，試驗參數(shù)，實驗儀器參數(shù)）